L'itinéraire a été commissionné en 1926, utilisant autant que possible des portions de routes existantes. À l'époque, la route n'est revêtue que sur 800 de ses 2 448 miles. Ce n'est qu'en 1937 que la route est revêtue de Chicago à Los Angeles.
Durant l'après-guerre, la Route 66 constitue un itinéraire majeur autour duquel se développent de nombreuses villes comme Amarillo (au Texas), Albuquerque (au Nouveau-Mexique), Flagstaff et Kingman (en Arizona). Des centaines de motels, de cafés, de stations-services, d'attractions touristiques et autres "curio shops" s'établissent le long de la route.
Avec le développement des autoroutes, la Route 66 perd de son utilité. Là où elle subsiste (de nombreux tronçons ont été repris pour construire les autoroutes), son usage redevient majoritairement local. En 1984, le dernier segment de la 66 est « court-circuité » à Williams en Arizona.
Tous les petits commerces et villages qui vivaient de la 66 ont été abandonnés, figés dans le temps. D'innombrables villes fantômes longent ainsi la vieille route, toujours ouverte au voyageur aventurier.
